Overview

I am interested in designing primers for Botryllus schlosseri to evaluate differences in expression of apoptosis, stemness, oxidative stress, and senescence related genes after an acute 24 hour exposure to two concentrations of nickel chloride, 5 mg/L and 45 mg/L, and a control.

Potential Gene List

This list serves as a jumping off point for myself to look into genes that may potentially be differentially expressed in Botryllus schlosseri exposed to the clastogen (by oxidative damage to the DNA), nickel chloride.

Role	Gene ID	Whole Gene Name
Senescence	TP53 (p53)	Tumor protein p53
Senescence	CDKN1A (p21)	Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A
Senescence	CDKN2A (p16)	Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A
Senescence	SIRT1	Sirtuin 1
Senescence	SIRT6	Sirtuin 6
Senescence	FOXO3	Forkhead box O3
Senescence	IGFBP3	Insulin-like growth factor-binding protein 3
Apoptosis	CASP3	Caspase 3
Apoptosis	CASP8	Caspase 8
Apoptosis	BCL2	B-cell lymphoma 2
Apoptosis	BAX	BCL2-associated X protein
Apoptosis	FAS	Fas cell surface death receptor (CD95)
Apoptosis	TNF	Tumor necrosis factor
Oxidative Stress	HSP70	Heat Shock Protein 70
Oxidative Stress	SOD	Superoxide Dismutase. Various isoforms, such as SOD1, SOD2, and SOD3
Oxidative Stress	CAT	Catalase enzyme
Oxidative Stress	HMOX1	Heme oxygenase enzyme 1
Oxidative Stress	NQO1	NADPH quinone dehydrogenase 1
stemness	MYC	Myc proto-oncogene protein
stemness	SOXB1	SRY-Box Transcription Factor B1
stemness	POU3	POU Class 3
aging and proliferation	HSPA9	Mortalin

Two Approaches for Acquiring Primers

Extensive search in the literature for pre-designed Botryllus specific primers.

For the purpose of expedience and accuracy. This generally is the preferred approach.

Gene	NCBI Accession Number	DOI	Fwd Primer	Rev Primer
Mortalin	KY212120	doi:10.1016/ j.ydbio.2017.10.023	TTCATGATACCGAA ACCAAGATGGACG	AATTTCCTCCTTG ATGGCATCCACC

Design primers in-house for Botryllus schlosseri.

Protocol

To design primers in-house for Botryllus schlosseri we will utilize the Botryllus Genome Project browser. Here we will use their BLAST tool to search for hits in query sequences as well as use their available sequecnced genome to extract those sequences which will allow us to design primers in IDT’s PrimerQuest.

Start with Gene of Interest: Identify your gene of interest. You might want to use annotated genes for more closely related species.

Go directly to NCBI select the database to be nucleotide, and paste in the following but replacing “GOI” with your gene of interest:

“((GOI[Botryllus schlosseri]) AND”chordates”[porgn:__txid7711]) AND “tunicates”[porgn:__txid7712]”

This will pull up any related gene sequences for your gene of interest for Botryllus schlosseri and any related tunicate species. You may use mRNA or protein sequences for your query, just be sure to select either blastn or tblastn, respectively.

Tip

Try to select sequences to blast that are shorter and more specific, ideally no more than 1,000 bp for sequences from a different organism. I noticed that sometimes if you blast a very long sequence from a different organism, you will get E-Values that look great but could be a potentially misleading conclusion. Longer sequences have more chances to match with a target sequence, so the E-value is less informative.

Try to select FASTA sequences from tunicates more closely related to Botryllus schlosseri. See diagram below for reference.

Figure 1: Genome Biol Evol, Volume 12, Issue 6, June 2020, Pages 948–964, https://doi.org/10.1093/gbe/evaa060

Retrieve Sequence: Access the gene’s sequence from NCBI Gene, by selecting the FASTA link. Copy the entire sequence starting at “>”.
Use Sequence in BLAST: Paste the sequence into the Botryllus Genome Project’s BLAST Tool to identify homologous sequences in the Botryllus genome.
Select Top Sequence: Identify the top sequence from the BLAST results, which has a significant alignment to your gene of interest. You will only want to pursue top hits that have an E-Value of ≤ 1e-10. Record the sequence ID, E-Value, and Score (bits).

Tip

Pay attention to the E value and Score (bits) to determine if your top hit sequence for the subject (Botryllus contig database) is significantly in alignment with the query. A commonly used threshold is E ≤ 0.001, which suggests that you would expect to see a similar match in a random database of the same size less than once by chance. For more stringent analyses where you want highly reliable matches, you can set a lower E-value threshold, such as E ≤ 1e-5 (0.00001) or even E ≤ 1e-10 (0.0000000001).

Retrieve Botryllus Sequence: You locate the matching sequence from the Botryllus genome by searching the “botznik-ctg.fa” file using the contig name you found.
Primer Design: Finally, we will use the extracted Botryllus sequence to design primers. We will design primers using IDT’s PrimerQuest Tool.

This method allows us to leverage well-annotated gene data to find potential homologs in Botryllus schlosseri, even when the genome may not be fully annotated. We will want to validate the primers and ideally carry out experimental verification to confirm the presence and function of the genes in Botryllus schlosseri.

Sequences Identified with BLAST Tool in the botznik-ctg.fa Database

Role	Gene ID	Query NCBI GenBank Accession	Query Organism	Top Sequence Producing Significant Alignment	Score (bits)	E Value
Apoptosis	TNF	LR791346.1	[Phallusia mammillata]	botctg065850	70	1.00E-09
DNA Repair	PolB	LR789137.1	[Phallusia mammillata]	botctg092056	60	1.00E-06
Oxidative Stress	SOD1	EE743567.1	[Botryllus schlosseri]	botctg006757	319	5e-86
Senescence, DNA Damage Repair	SIRT6	AB920558.1	[Polyandrocarpa misakiensis]	botctg109566	66	5e-09
Apoptosis	BAX	KU948200.1	[Botryllus schlosseri]	botctg061218	2260	0
Apoptosis	AIF1	KU948202	[Botryllus schlosseri]	botctg003666	674	0
Anti-Apoptotic	IAP7	KU948203.1	[Botryllus schlosseri]	botctg106479	1483	0
DNA repair	PARP1	KU948201.1	[Botryllus schlosseri]	botctg019995	1191	0
Stemness	MYC	OL828248.1	[Botryllus schlosseri]	botctg007779	2857	0
Stemness	SOXB1	OL828250.1	[Botryllus schlosseri]	botctg003503	1173	0
Stemness	POU3	OL828252.1	[Botryllus schlosseri]	botctg006949	1383	0

Note: For SOD1 I pulled the sequence botctg006757 twice, once for a different species of tunicates Styela clava, (but protein sequence) and again when I found the estimated SOD1 sequence for Botryllus schlosseri on NCBI. Because I am not finding exact matches to SOD1, I am going to just used the complete estimated sequence for my species on NCBI and not the contig.

Pulling Botryllus schlosseri Sequences and Placing in New File

In order to access the sequences for the genes of interest (GOI) it will be easier for us to curl the botryllus contig sequences fasta file now available on the Botryllus Genome Project website. I selected this file as opposed to the complete transcripts file since upon initial investigation, I found that it was more complete than the transcripts file. Because the Botryllus schlosseri transcriptome is not well-annotated, the contig sequences file may allow me to identify potentially novel genes.

curl -o data/botznik-ctg.fa http://botryllus.stanford.edu/botryllusgenome/download/botznik-ctg.fa

Let’s take a peak at the file we just downloaded.

head -n 10 data/botznik-ctg.fa

>botctg000019
TGACTTGACTTGACTTGACTCGACTTGACTCGAGTCACCTCCAAAAAACGAGTGACTTGA
CTTGACTCGAGTCACCTTTGAAAATCGATTGACTTGACTTGAGTCGAGTCAAAATCTGCA
ATGACTCGAGATGACTCGTGACTCGAAGGTAGTGACTTGATCCCAACACTGGTAGAGAGT
ACCTGACAAGGAAACGATTCTGAATAGGATGAAATGAACATTCGAATCGCGTCGCGAGGC
CATTCTGAATGGGATGTCAACACAGTCTGCTGGAGATTTACCCGATCTTGATCGATGCGC
ATTGGGTACCGTAGGTATAAAGCAGTGTTATGATCAAGTCACAGACGGCACGTAAAACGA
CTTTGGTAAGGAAAGTGAGAGCTCCACAGACGCTGATGTGGGTTGCCACTTCTGCAGGTG
TGCATAAAGCGCTGGTGAAATGTCTTGTATTTGCAGCTCCATTATTTGATAAACCTCGTT
TTAGTCCAATCGCTTCTTAATGAACATTTTGAGCTTTATGACCTAACCAGGAAAATGTGA

Create an empty extracted_sequences.csv file. We will upload this csv file to PrimerQuest directly.

touch output/extracted_sequences2.csv

Now let’s pull the sequence for the top hit contig. Below the code will check if the sequence identifier already exists in the extracted_sequenences.csv file prior to reprinting it into the file.

# Define a mapping of identifiers to gene names
declare -A gene_map
gene_map[">botctg065850"]="TNF"
gene_map[">botctg092056"]="PolB"
gene_map[">botctg006757"]="SOD1"
gene_map[">botctg109566"]="SIRT6"
gene_map[">botctg061218"]="BAX"
gene_map[">botctg003666"]="AIF1"
gene_map[">botctg106479"]="IAP7"
gene_map[">botctg019995"]="PARP1"
gene_map[">botctg007779"]="MYC"
gene_map[">botctg003503"]="SOXB1"
gene_map[">botctg006949"]="POU3"

# Output CSV file
output_file="output/extracted_sequences2.csv"

# Add column headers
echo "SequenceName,Sequence" > "$output_file"



# Loop through the identifiers
for identifier in "${!gene_map[@]}"; do
    gene_name="${gene_map[$identifier]}"
    # Extract the sequence and append it to the CSV file
    awk -v id="$identifier" -v gene="$gene_name" '$0 ~ id {flag=1; id_and_gene = gene; next} /^>/{if (flag) print id_and_gene "," seq; flag=0} flag {seq = seq $0}' data/botznik-ctg.fa >> "$output_file"
done

Let’s check out the extracted sequences in the csv file:

extracted_sequences <- read.csv(file = "output/extracted_sequences.csv")

print(extracted_sequences)

   SequenceName
1          PolB
2           MYC
3           BAX
4         SIRT6
5           TNF
6          AIF1
7          IAP7
8          POU3
9         SOXB1
10         SOD1
11        PARP1
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                         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TATTGTCCATTCTCGGTAATGTCCATTCTCGGTATTGTCCGTTCTCGGTAATGTCCACTCTCGGTAATAGCATTCTCGGTAATGTCCATCTCGGTAATAGCATTCTCGGTAATAGTAGGGAACCAGCTACTCGGCGTCTCAAAACTGTAGCCGCCAAACGCCATCTAGCGTCACCAGTTCAGCCGCCAAACGCCGTGTAGACATTCGGCCGCCGCGCGGCGTTTGGCGTCTGGCGTTTGGCCTCTGAGCGGGTTTAACCCCTGTTGATGATTTGGTTGACTACCATGTCACGTGGTGGCGTATTGTTTTGATTACTGCGGCTGCATTGAGTAACCGAAAACGTCCGCCTTTCACTATGTCTTGCGCAGCGTCGCTAACAAAGTAGCTCAATTCAAGGTGTTTTCTGCCGACGTTGCATAAGACATATTGTGGAAATAAGAAACTCGCAGTTGAGATCTGATTGTTCCATCGGTGAGATCGAATTTGTCGATTAGAATATATTGTGTCACGAAATTGAGAGGCAGATGAAATGATCAACCCTTCACCCACCCAATTCGCCATCGCCTACGGTGTTAGTGTTTTTCTGTCATTCTTTATTCTTATACCCGCAAGCATCGACTCGCACAATATGCGTGGAAATTGTTTGCTTACTGCAAAAGGTGAGAATAATGTAACCTGTGTGTTCGCTTTGTGCTTATGCTTTGAATATGGTTTTGATTCCTTTGAAACACGCTACGGTAATCCATGAGTACCAAGTTCGGTAGTATATGGCAGTGCGAAATCTTTTGGTGCTGTGTGTTGTGTCTTAATATTAACAAAGAACGTAATCCTATTTCTTTTTTGCAGGTTATTGGAATGAAACAAATGAACTGGTTGTGACATGGGGTCATCGATCAGCCTGCAATTTCATAGTGTTCATGGGTGTAGCATGCTTGCTATCCTCTCTATACTTCTTCTGGAACAGCATCTACTCTGTATGCAAGGGCTATGACGGGTAAGATGGGATGTACCGGTACTAAATCAGCTGACTAAAACTGAATGTAATTTCCATTAACAGCTCACCATTATTTTGTTTTGTTTCTCTTTTGCTGGGGGCATTTATGACAATTTCATTACTTTCTTCGTCGTTTATTGTTTCACTTGGTTACTCGTCTTGGTGTGACATTGTGACAGGAAAAAAAGATAATAGCCAAGTGTAAGTACATATTGCAAATATGATAGACTTGCATGCTATTTTAATGTAATGATGATGAATATGCAATTCTCAGGTGCTGGAAAGTTGACCTTGGAAATTTTAATAAAGAGTATCATGTGAACAGTGATGATTTTAGTTCAGACTTGGAAATTATTGAGGTATGTAATTTTATGACTTGTCTGGTAGATTCTCATATAGGCCAGTCTGCTTTTACTGGTTCCAACAGGCAACATTTACAGTATTTCCGTAATTTTGGTGGGTTGAAACTTATCCCTTGAATCCTTAAATCCCTTGAAAGAGCCTTCATGTTGACTATAAATTGTAACTTTTACATGACGTTAAATCGGACATGAAAGCTTTTTAATTTTGCTAGTGTGGGGGGTTGCCACAGCAGATCAGTGATTTGCATTGTGATCCGTCCTAAGCTGCACCCGTCCTTGGTGCCGGCTGGTACTAGTCTTGCTGACCATTGGTGTGTGAGACATCGAAGATATTTTGTCCCCATAATTCCTGTTGGTTGAACAAGGACTTGCCATGATCGGATTTTGCTTGTATTGTGTGTTGCTTGTCTAGCCATGCCGATACCATCTACATGACCAAGTTTCTACATCAATCAGCTTTGCTATTATCATCATATTATAATTTTTCAGTTTGGTTCATGGAGTTCTACTCTATCGTGGGTTGCCGCGACGGTCCTATCCTTCTTCAAAGTAAGATACTACCATAAAAATGAAGAACTCATTCAAGGACTGGCTTTGGAAAAGGATTCTCTCATTCCGTATCGGTTGCGTTATCAGAAAATCGACGAGGGTTCCTCATATACCTAATGTTGCATCCATCAATTCCTTATCCGTTCCTCTACTGCAGTTATTTTTGCCTCGCCATCAATATACACCGTGCTTACTGAGTATTATATACACACCTATACTACGTGGTTATTTCTGATATTATGTGGAGTATATCAATTAGCAGTTAATGGGAGTGGTTATATATGGATTCTAGAGAGCGCCTGTCATGATTCATCAGTGAGGTTGCAAGCTAGTTATGGCAGCGAATTTAAACTACCTGTCTAATGAGCTAATGGAGGGAATTTCGACCTCACCCTTACAAATGTTTGGCATGCTTGGGTTTATAGTCAAATTCGCTGCTATTAATCAACTCGTGGCTAGTAGACCATAATCCAGGGTTGTCACGACTCGTCTCGCAATTTTCTGATGACTGGAGTCATTTCCTCAAAATACGGAACAACTCGAGACTCAGATGGCCAAGATCGACATGTCATTGTAATTACGAAGAATAGTAAAAGTAACCACACTATTGCGATTTCATCTATTGGTACTGGAGAATGCTAAAAGTGTGGAAAATTAGTAGAATATAAATGTGAACCATTCGATATCACTCTACAGTGCAATCAACACGATGACTTGGACTCAACCTACTGCTCGCTGACTTGGACATAATACGGTGTTGAATTGAAAATGACTCGAGTCAAAACTATAACAGTGAAATTGGTTTGTGACTCGGAGCTGTGTGACTTGGTCACAACCCTGCCATGATTCTCCAGTTAACAATAGCAGCGAACTTGACCTGTCTAATGCTGATCTAATGGAGTGAATTTTGACCCCTTCCTTACAAAAAGTATGCAATATGGTCTGTTAGCCATGATTCTCCAGTTGGGGTAACTCGATCATACATCATGCAATAGCAGTATATTCACACAATGACTAAGATAACAGCGGTAACATGAAGGCAGTAACGCGAAAATGATCGCTGACACATGCTTACAATTGCGAATTCAGCAGTTTATTTACACGATGAGAAAAAGAAACAGCGGTAACATGAAGTCAAAAAGGCAGCAAAGCGAAAATGATGGTCAACAGATGCTTACTATTGCGAACTTGGCAATGAAATCACCACAACAGATAGCACAAAATGTCATCAGCACTACACTGCGTAATGCTTTTAGTAACAACCACAACAGATGATGGCACTTACCATTGACTTTGCATATTGAATTTAGTCTTCACTAAATATCTCAAGTTCACTTGCGCTACATCGTACACTATGTATTCATTGTAGAGTAACGACGTTCCTTCACAGCCAGACTCCTTCCCGGACCCTACATGGGCTATGGTGCCATCTTTCATCGTGTAGTCGCTCGATTCGTCCGGGCATGTGGACCCCATACCCTTGACGCTGTGCTTTCCTTTCGGTAGCTTCCGTACGTCCATGGCATTCTTCAACTCGCGCCTAAAAAAAGGTGGCACGTCGATATCACTGTACAAACAAGTGCACACTCAGTAATGAACTCACATATTTCCCAGCGCTACTTCAGCGAGCAATAACAGTCCGTATGGATTCCCATGCGACGCATGGCAGTAATTCGCACTTTTCGAAACCATATCGGCAAAGTACAACCCCTTGCCGAACATATATCCCGTCTGTAATGCAAGAGTCATAATTTTCCAATGCAGTAGCAGGTGAATATAGAGGTTTTTGCAAGCAATTTTTGAATGCAGGGAAGTGACGATAAAGCATTTTTCAAACTGGACCGTTCAGTGTTTGTGACAGGGTGACTAATAATGAAGTTTATACAGATTAACCTGTGCGGATCACCTCGATAAGATACACTCGCCATATCCAAGTTGTTTCGACCGCTTGCTATCTTTTTATTTTATCACAATTTTGTGGTACTGTCAATTGATAAATTCATCATTAAACTGAACGGAACCGACATGAAACCAGCGGGGTCAATCAAATGTGCAAAGGCCTCTTCCATAGGCTAATGCAAACATGGAATATGTTTATAAACCATTTCCAGCGGAGGACGCACCTTTGTTCTTGCATGGTCTCAGAACAAACGCCTGGGCGAGTTTTGGGTGGGAATGGGTGATTCAGTGCCCTAGATGTCAACAAGTGGATACTAAAATCAGGCAGAAAGAATCTATTTACATTAGCGCACATCAGGAACCAAAAGGCGATAAGTGCCGAAATTCGAGCGAACAACATTTCATGACGTACCACAGGCGCTTCGGGCGGCGCAATCCTCAAGCCCTGTGACAAAATGCCGGCGTAGTTGGTCACACGAGAGCCATGCCACAGCAAACGACGGTTGTGCAGCTTCTTGAACGGCCGGTAGCGGCTTTTTTCACCTTAAAAACTGACGAGGTCAGCCGTCGCCACGTCAGACGATTACGAGTTCATTCAGCCTACCTTTACGGTCCAACTCAAATATTTCTTCGACTTCGAGACTGTATGCGGAATGGGTCTTGGCGTGAGTGTTTTGCACCATGTCGCCGATCACGTTACGCATTTCGTCGTTGGCATCGAGTGGCTGCGGAGAAAAATTTATTTTCCGACCGTGAATACCAGAGGCGGTCAGTAACAAAGTGCTTCTACTTTTCATACCAAACTCCAGTGAAAACATGTATTTGATGTCTTCTACGCTACTTTCTTCCAAGTAGTTTTCTGTCTACTTGCAATAGTTGATCAAGTGGTTACGATTTTAAACTGCTACTTCTACCTAACAAAAAAGTTCTAGAATTACTAGAAAGTCGCTACTTCTATTTGTGCTCAAGTAGATGAGATAGTCAGTAAGGAAGTACTCGTCTTCAAGAGGTATTCAATACTTACTCAAGTGGTTTTAATTTTCAACTACTGCCACTCACCAGTTTCGAGTGTTAGGCAAAACTAGGCCTAGAATACTTTTACGTAATTGGAAACCGTTACTTCTACTTGCATTTGAGTATCAACAATGACTACTTTGACAACATCTGGTGAAAATGCTCCGGACAAGTTGGGAAACACGGAGAAAGCAAGGTAACCTCTATTCGGCATTGCAGTTTCTTGTACTGAGTGTCGATGGGGTCTTCCTCCTTTACGTTGGCGTAGTCGCCTTGGAGCAGATTGTACGCGACCTCTATATCCAGCAGGCTGTCGATCATCTCGACCTGTCGTGCAAATTCGGAGAATTAGAAAGAAAGAACATTGTATATAAAAATCGCATCACAGAATCCGACGATTGTTAATATAAAATGTTCTTTCCAATCCTCACTAATTGCTGACGATCAACCCATACGAGGGTTAGCCGAAAATACACGGATTCATTCCAATATGAACATACAATTCAAATGCAATTGCAGTTCTGTACCTTAAAGAAGCTCTTCAAATACTTATAATTCAGTAGAGATTTACAACGTTACTTATACTCGAATAGCAACAATGGTTACTTTAGACACCTCTGTTGAACACCGGCGATCACGGTTAGCTGTGTAGCAACACATGACGATAGTTCGGGGCCACTGATTATGACCTAAGCACAGCATTCCTTTATTATTCTCCACACAAACCACACCAACACGGACACCGTGTTATACGCAACAACAACGTTAAACATAACCAGTTATCTACCTTGGACTTGACCAACTCTATGTTGTTCAGCATCGGCGGCTGTTTCATTCCGAAGTCATGCGGGATCAAAGTGTAAAATCTGTTTGAGCAATCCAGTATTTTGGGAGCGCTTGGTGTTTCGCTTTCAATAATCTGAACGGGAAGACATACTATTATGAGAAGCATCCGCAGATTCTTATGAATGTGGGAAACATTCGCTTCAGTCTGTACATGATTTATATTTCTATGGATTCAAACTCCATATTCTTTGGTTAATCGTCGATCATCGAGACAAATTTTTGACATTTCAACAAAGCAGAAGTTTTGTATTAATACATCATGTTAAAATAGTTCTTTGAAGTGTTTTACCTAAAAATGCGTTCACAATCTTGTCATAACTCTAATTCTCAGTTCCTAAAGAGTAACATCCAGCACATCCTATATTGTTTCACAACACATTTGTACGGATAGAATTCGCTTGAAAGCGGAAATTCAAGTCACGAGCGACTAAACGTGGTTGTCTACAGCTAAAAGAGAATCAATCAATTGACCCAATGTAATGTTAACGATCGATGCGAGAGACATTGCAGAACAAAGCCCACTTACCCCGGTCACTTCGGACAGTACCCCGTACGCTCTCTGCAGCTGCTTCTTACTTAACTTACCGAGAGGCATCTTTTTCATATCCAGCTGCAAAACAAACGTTGCTAGGAGGACCGTAGCCCTTCAACGCAGAAGCGATAACGACCAGTCGCCAACCAACCTCGAATTCCACCATCGCCTTCTTCATGCTTTCCACGTCAAATATCATCTTGATGATCTTTTGCACTTCTTCATGTAGCTTCGAATTGCTACCGGCAGATTGCAAGCCCTTCAGCTTCTCATCGTTTTCACCGTAATCGATGTCGAGAGGATAAAATTTTCTGGGCATCTTCACGAAATGAGCGGTGCCAAATTCGTTGCCTGAAATGTCAGAAACATTGAAATGACCCCTGAATATTTCTCATATAGCTGGCATTAGGTAGACATACTTTTGAACTTAGTTCATGTCATGCGCGGATGCGATGAAAATTTGGTTTTAATTCGACACCACACATTAGCTCGCACATTGATATCTTCGTTGCTCACCAGTTTTATCTAAATAAATTTCTTCAAAATTTCTCAGTGCCGCATCAACGGAATAGAAGTCCTCGACTTTATCTCCCCCTATCGTCGTCCCAACTCGACCCCAGGCCCGGAACACATAATATTTCTTCTTCGAGTCATGCTCCAGAAGCTAGAGATTCGATAAGATGCGGGCACAAATTAACAAAACCTGTCACTTACAACAATACCAGAACGCGGTACCTGCAATTTATAATAGGAATTTGCGCCCGTATTCATGTCCACCAAGGATAGGGTTGCTGTGTACTTCGAGCCGTTCTTGACCTAAAACAATTGAGACATTCGAATCACGTAAAAGTGTTATGGCACAAGACACAAAAACATGTGAAAATATACAGCGGTGCAGGAATCAACACAATTTCATAGACAGTAATTATCTGACCAAGAAATATAATGAAATACAGGAAAGAAAATACCACGTTTTTGATAGAATACCGTATGTAAAACTTTTAAAAAATAACAACGCATAGGAGCAAAATAAACCAATTATACATAGAGGTAAACACATGAAACGAAGATAAGCTGAAAATTAGGTCCTGATAATACTTCGGCAGGGACACAAGTTCAATATTAGAGATTAAATTCAGAACAGAACCAACTGCTGAGTGTTGATATTTTAAAAATTTCGTCAAGACGCATCATAATATATCTGACTCCATCAACCGGCTTTCTCAGCAATGCATCACCGATCGAAACGAGGCTTACACACGGTCAAATTACATTAGCAAGTAGCAACTTAGGCGAAACACTCACCAGAACATGAGTTTTGTGCTCCAACCCAGACTGCTGATCAACTGCAGCGCCCGCTTTGACCACCATCTTCATTTTTTTCTCTGGCACGTTACCACTAACCTCCTCGAGAGCTCTTTTATAACCCAAGCCTCGATCCTGTTGCTCCGATCCCCAATCGCACACGCTGTGCTTTTTGAGCAAAGGCAACATCGGCTGTGGCTCCGACACGGCCTCGAGATCTTTCAAAATATCTTCAGAAACGACAAAAACATCTTGTAGCTGAGCCGAATGCATTTTTTTGCTCATTTTAGCAACTCCCTCCTTAGTGCTGATGCAAAAGTACGCCAGATGCACGGACGTAGTGATCGAACCGCCGAGCTTTTCGACAGACGCCTTGATGTCAGCCTTTGGTGAAAGCGTTTTTGTAAGAACGATAACCTTCATTTTTTTCAACGGCTTGAAAGGCGCTTTCGGCGGAAAAACGCGCTCCATTTTTTTATACTTATATTTCTCAAGAAACGGGTCTGATTCTCGGACGGATTTCGGGAACGACCAGGGTTGTCTCTCGACGACGGCCGTCCTATACGTGCACCGGGTCCATTCCGATATCTGTCCGGTGCATTTATATCCGTCGCTGCAGACCACCAGCGGTCCCGCTTTGCATTCCGGACACCAGGGCAAAGCCCCGAACGTCATGCCGTCACCGATGGCGAGATACAATGCGTCGTAGCCGATGGGTATTTTCTGATGATTTTCTTCCAGTATGCCTTCGAGAACGTCTTTGCGAAGTTCGATACTTTTGAGTCTGTCGATGTTCCTCCACATCAAGGTTGACTGCGATTTGATTTTTTTCATGATCAGGTCCTCTTCCGTTCGAACTGAAGGCAAATTCTACATAAGAACCGGTGCCTTGAATGATTTATACAGACGAAACAAATCTCTTTTGCCCAAGGAGTGCCCGAGTGGTTCTCAATCTTTTTCTACCCAAGGGCACCCTCTGAAAATGATGATAGTTTGCGCAGCCAAGCCATTCAGGACTATGAAAGCGAGATTTGTGAAGCTGATGACTAGGACATCAACCCATACCTAGATCACTTCACTGGTCAGCTGAAGATGTTGATGCTGGGCGACTAAAAAAGGTCATTCTCATTAATCATGGACTCATTGAGAATTGGAGATTTAGTCATCAGCTGCCAAAATGCTACTCATATGGATGTCCTTAATTTTTGTTAGCGCCTACTTGACAATGAATTTTACATAGAAGCTTTGCAAGTGCCATAAAACCAGTCCCACCAATTTCAGAAGCGGCTACTTTGACATAATGATATGCATATTATAGTGTGGCGACACATTGCAACATTTGACACGTTAGAGAAATGGACGTGTTAAGGCGATTGATGCAAATAAGGCATCATATTCAACGCGTTGTCACGTTAGAAGTGAAGAAAAGACGAAGAGCTACCCGACAACATCCACCAGTGGTACAGAATCTTACTTTCAGAAGTTGAAGGCTGTTCCGCAATCTTTTTTGCCTTTCCTTTAGGCTTCAGTAGTTTCCTCATCTGCGCTTTGTCGTCCGCGTCCAGCCCTTGGAACCCGGAGAGCATGTCCGCACTGAAGTGATCTTCCCAGCCCATTTCGGCCTTGTGTTTCAAGAAACATCCGACATGATGCCAACGATCAACAAGGCCGAGCTATCAAACAACACCAAATGCATATTAGACGGGTGAAATCATGGGAGGATGATGCGCCTTTGGCCCTGGGTCAGTGGTTTTCAACCTGTGGGTTGTCTGCCTTTTTTTTCTGGTGGTCGTGATCATGAAGGTACAGTCCTTTTTACATATGCAATAAGCTTCCAAAATAAGCCGTGAGCAGGTTAGGCGAGTAGCACACCAAATTTAGATTTCCAACTGGAAATTGGGCCGCAACCATAAAAAGGTTGGGAGCCACTGCCCTAGGGCTTTTCGACTGACGAAAAATGCGCCATCAACACACAAATCTTAAACGCTAAAATCGCTGAACACTTGAAAACATCGACATCAACAATAGGCTACCACTACCTCCCCAGCAGCACTTATTAGCTTAAAAATCAGCATGCAAGTGCTACCACCGCTGGTAGTAGCAATGCTCACCTGCGGCTTTTCGGGATGCTTCTCTTTGTGCGACAGCCGAATTTCGTCCTTCTCAATTTTATCCTCACATTGGCGGCATTTGCTCCTGTTAGACGCCGCGTATTGAACTACAAAGTCTCGCAGCGTCGTCGATATGATCTGACCGCAATGTTGGAAAAAATTGAGGAATTTGTAAGTCGGTGAAATTACTGTGGCAACATACAAGAAATCTATCAAATCAGGCGTATCACCGAATTCATAGTTAAATATAATTTAGCCTTGAATTTGCTTGGAGTTGCAATATCTGTATTGAAATTCAGAACATGAACAGTTAACTCAACCTTGCACCTACTTTCATCTTCACATGACTCTGAAAGTCTTTGCATATCTAGCAAATATCAACTGTAGTGAATCCCCCTCCTACCCCCAATCAATGGGGCAGTGACACAATGAATAATGCAAATAACCTGCCCTGCCCGGGCTTATAGAGCATCGTTACCTTTGTTCCACCTTTTGCAGACTTGGAACTATTTGCAAAGCCATCGATTTGCGTTCGAATTTTTTCTTGGTCTGGAAATCGGAGATTGTTGAAGCCCTTTATGTCATCGGAACAGGTAGGTCGATATTTTCGGAAGAAACAAGTGTAATGGTACCAATTTGGTTGCTGGAAATGAATAAAACATATTGGGTAAAAATTCTCAAGTATTGACTAGCCTATAAAGACAAAGAGGTCTATTTACTAGCTAATTTGAAAAATAACACTGAAACATATATACACAGTAAAGCGATGCGATCAATAACTAAATTAACGTAGTAGCTCACAAAATAGCCTACATTGTACAGGTATGCGGTTTCAATTCAAATTAGATTAAAAATGAACATTACAGGTACAGCTGCCAAGTATAAAATACCCACATACCTTGCCATCAAAAAATCGTGACTGTACCATGTAAGCAATTCTCAGACTTTCCTTGGCTATCAAGGCTTTGCAATCACGGCACATAGCCTTGTTACTCTTCGCATATTCTGCGACATAGTCATAATCATTACTACGCCCATCCATTTCGATCAAGTATCAATTTCAATTGCACCCAAGGAATCTATAGAAAATTCATTACAAGTTGCTATCCAAATCCAAACAAATGTACTGATAGAATATTTCTTATATTTAATAAAATTATTTCCAGACATATCGCAACCAATCATCAGCGGAAACCACATCGATGGATGAAAATTATTGCAAGTAAGAGTAATAGACTGCTATCATCGTAGCACGATTTTCATATAAACGGAAATAAAAAATGAGTCACCATGAACATGAAAATACAAAATGTGATAAATCTAGAATAGTAGGACTATTATAGGTAGTTTCTCGACTAAGATATAGCTGAATAAACTAGCACTGTCGTTTTAAGTCAACATAAATCACATCCATATCGATAAAAAAAAAGTCATCTATGAATTGCGCTGATGAGTAGCGCGTCTACATATTTTTCCAATTTCAAATATAAAATCATCCAGGATCGTTTTCCAAGGACCACTCAGATTCTAATATACTCATCTAATTATATACTCTAAGATAAAAGTAAATTAGGACATTTTTAGGTCCGACACGATGTCCAATTATCACTTTGAATATGTCCTATTAATACGGGTAAATTGCAATCATCAGCCGCGCCTATGTACCATTTTCAAAGTTCATTTAGCAATACCCCGGACAGTTTCCCGAGGACAAATATGGTTTTAATATACTCCAATGATCATAAACGTTGATATAAAAGTAAATTCAAACAATTCTA

Warning

Although we were able to identify sequences from the contig database that match really well with our selected genes, there will be cases where we may not utilize them anyways. Particularly, if there already exists sequences on NCBI that are labeled as the complete CDS for our GOI for Botryllus schlosseri, then just use this directly in PrimerQuest. For GOI’s that do not have this, proceed with the sequence extracted from the contig data base and plug it into ORF Finder before taking the sequence to PrimerQuest.

Locating Protein Coding Regions (CDS)

Before we use PrimerQuest, we want to identify the open reading frames of the GOI sequences if the sequence has not already been identified as the complete CDS on NCBI for Botryllus schlosseri. An open reading frame (ORF) is a portion of a DNA molecule that, when translated into amino acids, contains no stop codons. Doing this step will improve the specificity of our primers as to make sure we are targeting the protein coding region of the gene.

Go to ORF Finder and plug in one of the gene sequences from our extracted_sequences csv file.

This means you will use ORF Finder for sequences that are labeled as partial CDS and for gene sequences that were identified for Botryllus schlosseri through a closely related query organism’s labeled gene sequence.

From here you can take the sequence produced and plug it into PrimerQuest. Make note of which ORF you will use in your primer design excel sheet.

Designing Primers with IDT PrimerQuest

Note

We will be using SYBR Green for the qPCR we are conducting so when on PrimerQuest select qPCR Intercalating Dyes (Primers only)

General rules for designing good primers:

20 nucleotides in length, ideally
50% GC content, ideally
Tm’s of forward and reverse primers must be similar (2oC differences tolerated).
Primers cannot form stem-loops (hairpins) upon themselves. On PrimerQuest, it will show you the probable hairpins that may form and associated values relevant to stability, melting temperature, etc. You will want to select primers that have the fewest number of hairpin possibilities and have the lowest absolute delta G value (free energy) which would indicate lowest stability. Additionally, you want primers with hairpins at lower Tm’s (melting temperature) since it indicates that that secondary structure will more likely unwind even at the lower temperatures during the PCR reaction.
No primer-dimers greater than 6 bp between each primer and itself and also between the two primers.
Forward and reverse primers should be about 500 bp apart.
The 3’ end of the primer should be a G or a C.
Amplicon product should be 70-200 bp in length.

Final Primers

Number	Gene	Forward Primer (5’-3’)	Reverse Primer (5’-3’)	NCBI Accession Number (If complete CDS)	Botryllus Contig Sequence (if no complete CDS was found)	Amplicon Length	Source
1	BAX	CATTGACCTTGCGTGTTATTGG	AAGATGTCCTTGGTGGGTTG	KU948200.1	None	97	in house
2	POU3	CAGTAGGTCTTCGCATCCATC	CGTTTGCATCGTTGGTGTAAG	KU948203.1	None	80	in house
3	PolB	GGCTTCACAATCAATGAGTATTCC	AGCAATCTTTCCGCATTCATTC	None	botctg092056	NA	in house
4	TNF	GTTTCAGTCAACACCTTGTGTC	AATCTCGACCGCTGACTTATAC	None	botctg065850	131	in house
5	SOXB1	GGGAATGTGTTCATCCTCTGG	TGAATCCAGGAGTTACTCAAGTTC	KU948203.1	None	116	in house
6	MYC	GAAGTCCTGGCTAAGATGCTAC	AGCGTCAAGAAGGAAGTACG	KU948203.1	None	119	in house
7	AIF1	GGATTCTCTCACCGATGGAATAG	CCTGACTTGGAGCCTTTATGG	KU948202.1	None	102	in house
8	SOD1	CAATCCATATAACAAGGTTCATGGC	TGATATCCACACAGGCACAAC	EE743567.1	None	107	in house
9	PARP1	AATTTGGCACCGCTCATTTC	TGCAAGACCTTCAGCTTCTC	KU948201.1	None	94	in house
10	SIRT6	ATTAGTACCGCGTCTGGAATAC	GGATGGAATCGCTTCTTCAAATC	None	botctg109566	114	in house
11	IAP7	GGTCTCTTCACGGACATCTTC	GCTCAGTATGTTGTGCTTGTTC	KU948203.1	None	111	in house
12	HSP70	CGAGAAGTTGAAGGACAAGATCTCCG	TCTCTGCAGTCTGGTTGTTGTCGAGC	NA	NA	NA	doi:10.1016/j.ydbio.2017.10.023
13	Mortalin	TTCATGATACCGAAACCAAGATGGACG	AATTTCCTCCTTGATGGCATCCACC	KY212120.1	None	79	doi:10.1016/j.ydbio.2017.10.023
14	ACTb	GTAGGTAGTCTCGTGAATTC	CACGCCATCTTGCGTCTGGA	NA	NA	321	doi:10.1016/j.dci.2006.12.009
15	18s	GGCAGCCTCCGGGAAACCAAAGTC	CTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTC	NA	NA	NA	doi:10.1016/j.ydbio.2017.10.023