curl -o data/botznik-ctg.fa http://botryllus.stanford.edu/botryllusgenome/download/botznik-ctg.fa
Overview
I am interested in designing primers for Botryllus schlosseri to evaluate differences in expression of apoptosis, stemness, oxidative stress, and senescence related genes after an acute 24 hour exposure to two concentrations of nickel chloride, 5 mg/L and 45 mg/L, and a control.
Potential Gene List
This list serves as a jumping off point for myself to look into genes that may potentially be differentially expressed in Botryllus schlosseri exposed to the clastogen (by oxidative damage to the DNA), nickel chloride.
Role | Gene ID | Whole Gene Name |
---|---|---|
Senescence | TP53 (p53) | Tumor protein p53 |
Senescence | CDKN1A (p21) | Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A |
Senescence | CDKN2A (p16) | Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A |
Senescence | SIRT1 | Sirtuin 1 |
Senescence | SIRT6 | Sirtuin 6 |
Senescence | FOXO3 | Forkhead box O3 |
Senescence | IGFBP3 | Insulin-like growth factor-binding protein 3 |
Apoptosis | CASP3 | Caspase 3 |
Apoptosis | CASP8 | Caspase 8 |
Apoptosis | BCL2 | B-cell lymphoma 2 |
Apoptosis | BAX | BCL2-associated X protein |
Apoptosis | FAS | Fas cell surface death receptor (CD95) |
Apoptosis | TNF | Tumor necrosis factor |
Oxidative Stress | HSP70 | Heat Shock Protein 70 |
Oxidative Stress | SOD | Superoxide Dismutase. Various isoforms, such as SOD1, SOD2, and SOD3 |
Oxidative Stress | CAT | Catalase enzyme |
Oxidative Stress | HMOX1 | Heme oxygenase enzyme 1 |
Oxidative Stress | NQO1 | NADPH quinone dehydrogenase 1 |
stemness | MYC | Myc proto-oncogene protein |
stemness | SOXB1 | SRY-Box Transcription Factor B1 |
stemness | POU3 | POU Class 3 |
aging and proliferation | HSPA9 | Mortalin |
Two Approaches for Acquiring Primers
Extensive search in the literature for pre-designed Botryllus specific primers.
For the purpose of expedience and accuracy. This generally is the preferred approach.
Gene | NCBI Accession Number | DOI | Fwd Primer | Rev Primer |
---|---|---|---|---|
Mortalin | KY212120 | doi:10.1016/ j.ydbio.2017.10.023 |
TTCATGATACCGAA ACCAAGATGGACG |
AATTTCCTCCTTG ATGGCATCCACC |
Design primers in-house for Botryllus schlosseri.
Protocol
To design primers in-house for Botryllus schlosseri we will utilize the Botryllus Genome Project browser. Here we will use their BLAST tool to search for hits in query sequences as well as use their available sequecnced genome to extract those sequences which will allow us to design primers in IDT’s PrimerQuest.
- Start with Gene of Interest: Identify your gene of interest. You might want to use annotated genes for more closely related species.
Go directly to NCBI select the database to be nucleotide, and paste in the following but replacing “GOI” with your gene of interest:
“((GOI[Botryllus schlosseri]) AND”chordates”[porgn:__txid7711]) AND “tunicates”[porgn:__txid7712]”
This will pull up any related gene sequences for your gene of interest for Botryllus schlosseri and any related tunicate species. You may use mRNA or protein sequences for your query, just be sure to select either blastn or tblastn, respectively.
Try to select sequences to blast that are shorter and more specific, ideally no more than 1,000 bp for sequences from a different organism. I noticed that sometimes if you blast a very long sequence from a different organism, you will get E-Values that look great but could be a potentially misleading conclusion. Longer sequences have more chances to match with a target sequence, so the E-value is less informative.
Try to select FASTA sequences from tunicates more closely related to Botryllus schlosseri. See diagram below for reference.
Retrieve Sequence: Access the gene’s sequence from NCBI Gene, by selecting the FASTA link. Copy the entire sequence starting at “>”.
Use Sequence in BLAST: Paste the sequence into the Botryllus Genome Project’s BLAST Tool to identify homologous sequences in the Botryllus genome.
Select Top Sequence: Identify the top sequence from the BLAST results, which has a significant alignment to your gene of interest. You will only want to pursue top hits that have an E-Value of ≤ 1e-10. Record the sequence ID, E-Value, and Score (bits).
Pay attention to the E value and Score (bits) to determine if your top hit sequence for the subject (Botryllus contig database) is significantly in alignment with the query. A commonly used threshold is E ≤ 0.001, which suggests that you would expect to see a similar match in a random database of the same size less than once by chance. For more stringent analyses where you want highly reliable matches, you can set a lower E-value threshold, such as E ≤ 1e-5 (0.00001) or even E ≤ 1e-10 (0.0000000001).
Retrieve Botryllus Sequence: You locate the matching sequence from the Botryllus genome by searching the “botznik-ctg.fa” file using the contig name you found.
Primer Design: Finally, we will use the extracted Botryllus sequence to design primers. We will design primers using IDT’s PrimerQuest Tool.
This method allows us to leverage well-annotated gene data to find potential homologs in Botryllus schlosseri, even when the genome may not be fully annotated. We will want to validate the primers and ideally carry out experimental verification to confirm the presence and function of the genes in Botryllus schlosseri.
Sequences Identified with BLAST Tool in the botznik-ctg.fa Database
Role | Gene ID | Query NCBI GenBank Accession | Query Organism | Top Sequence Producing Significant Alignment | Score (bits) | E Value |
---|---|---|---|---|---|---|
Apoptosis | TNF | LR791346.1 | [Phallusia mammillata] | botctg065850 | 70 | 1.00E-09 |
DNA Repair | PolB | LR789137.1 | [Phallusia mammillata] | botctg092056 | 60 | 1.00E-06 |
Oxidative Stress | SOD1 | EE743567.1 | [Botryllus schlosseri] | botctg006757 | 319 | 5e-86 |
Senescence, DNA Damage Repair | SIRT6 | AB920558.1 | [Polyandrocarpa misakiensis] | botctg109566 | 66 | 5e-09 |
Apoptosis | BAX | KU948200.1 | [Botryllus schlosseri] | botctg061218 | 2260 | 0 |
Apoptosis | AIF1 | KU948202 | [Botryllus schlosseri] | botctg003666 | 674 | 0 |
Anti-Apoptotic | IAP7 | KU948203.1 | [Botryllus schlosseri] | botctg106479 | 1483 | 0 |
DNA repair | PARP1 | KU948201.1 | [Botryllus schlosseri] | botctg019995 | 1191 | 0 |
Stemness | MYC | OL828248.1 | [Botryllus schlosseri] | botctg007779 | 2857 | 0 |
Stemness | SOXB1 | OL828250.1 | [Botryllus schlosseri] | botctg003503 | 1173 | 0 |
Stemness | POU3 | OL828252.1 | [Botryllus schlosseri] | botctg006949 | 1383 | 0 |
Note: For SOD1 I pulled the sequence botctg006757 twice, once for a different species of tunicates Styela clava, (but protein sequence) and again when I found the estimated SOD1 sequence for Botryllus schlosseri on NCBI. Because I am not finding exact matches to SOD1, I am going to just used the complete estimated sequence for my species on NCBI and not the contig.
Pulling Botryllus schlosseri Sequences and Placing in New File
In order to access the sequences for the genes of interest (GOI) it will be easier for us to curl the botryllus contig sequences fasta file now available on the Botryllus Genome Project website. I selected this file as opposed to the complete transcripts file since upon initial investigation, I found that it was more complete than the transcripts file. Because the Botryllus schlosseri transcriptome is not well-annotated, the contig sequences file may allow me to identify potentially novel genes.
Let’s take a peak at the file we just downloaded.
head -n 10 data/botznik-ctg.fa
>botctg000019
TGACTTGACTTGACTTGACTCGACTTGACTCGAGTCACCTCCAAAAAACGAGTGACTTGA
CTTGACTCGAGTCACCTTTGAAAATCGATTGACTTGACTTGAGTCGAGTCAAAATCTGCA
ATGACTCGAGATGACTCGTGACTCGAAGGTAGTGACTTGATCCCAACACTGGTAGAGAGT
ACCTGACAAGGAAACGATTCTGAATAGGATGAAATGAACATTCGAATCGCGTCGCGAGGC
CATTCTGAATGGGATGTCAACACAGTCTGCTGGAGATTTACCCGATCTTGATCGATGCGC
ATTGGGTACCGTAGGTATAAAGCAGTGTTATGATCAAGTCACAGACGGCACGTAAAACGA
CTTTGGTAAGGAAAGTGAGAGCTCCACAGACGCTGATGTGGGTTGCCACTTCTGCAGGTG
TGCATAAAGCGCTGGTGAAATGTCTTGTATTTGCAGCTCCATTATTTGATAAACCTCGTT
TTAGTCCAATCGCTTCTTAATGAACATTTTGAGCTTTATGACCTAACCAGGAAAATGTGA
Create an empty extracted_sequences.csv file. We will upload this csv file to PrimerQuest directly.
touch output/extracted_sequences2.csv
Now let’s pull the sequence for the top hit contig. Below the code will check if the sequence identifier already exists in the extracted_sequenences.csv file prior to reprinting it into the file.
# Define a mapping of identifiers to gene names
declare -A gene_map
gene_map[">botctg065850"]="TNF"
gene_map[">botctg092056"]="PolB"
gene_map[">botctg006757"]="SOD1"
gene_map[">botctg109566"]="SIRT6"
gene_map[">botctg061218"]="BAX"
gene_map[">botctg003666"]="AIF1"
gene_map[">botctg106479"]="IAP7"
gene_map[">botctg019995"]="PARP1"
gene_map[">botctg007779"]="MYC"
gene_map[">botctg003503"]="SOXB1"
gene_map[">botctg006949"]="POU3"
# Output CSV file
output_file="output/extracted_sequences2.csv"
# Add column headers
echo "SequenceName,Sequence" > "$output_file"
# Loop through the identifiers
for identifier in "${!gene_map[@]}"; do
gene_name="${gene_map[$identifier]}"
# Extract the sequence and append it to the CSV file
awk -v id="$identifier" -v gene="$gene_name" '$0 ~ id {flag=1; id_and_gene = gene; next} /^>/{if (flag) print id_and_gene "," seq; flag=0} flag {seq = seq $0}' data/botznik-ctg.fa >> "$output_file"
done
Let’s check out the extracted sequences in the csv file:
<- read.csv(file = "output/extracted_sequences.csv")
extracted_sequences
print(extracted_sequences)
SequenceName
1 PolB
2 MYC
3 BAX
4 SIRT6
5 TNF
6 AIF1
7 IAP7
8 POU3
9 SOXB1
10 SOD1
11 PARP1
Sequence
1 TGGTTTTCTTGAATCACGGAAAAAACTCGACTTGAGTCAATTTGTGTATTGGCTCGACTTGTACTCGAACCAAGTCATTTCACTCTAGACTAGGACGGCCAAGACAGGCATTTCATTGTAGGTTCTAAAAATAATGAAGTTACCACATTATTGGTATTTCGTCAATCAGTACTGGTACTTGAAATGTAGGGCGAGAAACTGGTAAGAATTAGGAAATTAGTATATTATGAATGCGAGGCATTCAATATCACCAAAACTGAGTTGAAAATGGGTTGAACATCATGACCTAAAGTTAAACCTTTACTTCCCAACTTCGACTCAGATTTGACTCGGTGGTGAATTGACAATGACTCGACTTGAGTCAAATCAAAACAATAAAAGTGAGATTGACTTTGTTACAACCCTGGCCATTACAACTAAGTTATTGCAACAATTATTCTATAGATACTTCGAAGATTTTGAGAAACGAATCCCACGAGCAGAAATGGATGCATTAGAAGTGAGTGTCCCATCGCATTTCGAAAATATTTAGTTTTTATAATTTGGGGAGTGACACCATTCATTTTGTTTCAGAGTTTGATCAAGAAACGTGTCGCAGCGTTGGACAAAGAATTCAAGTGTCAAGCGTGCGGGAGCTACCGTCGAGGAAAATCGTCGAGTGGAGATATTGATATACTGCTCACTCACTCTTCATTTTTGTCTACTAAAATAGAGNNNNNNNNNNNNNTCAGGATTTCCTAAGTAGGTAGCACTGAAAATAACATCGTCATTCACCAGCAAAAGAGCTACTGAATCGTAGATATTGCTGAGAAGTTTCACTGTACTAATAGTTTTTAATCGGCTCGATGACGTAAGATTCTTGAAGTAAATGAATACAGGCTACTTTTGATGTTTGAAGAGATGGAACATGTCGACTGCCGCCTCCTGAATTGATATCAATAAACACTCAAATTATTTTTGAACAGTCCCGTATGCGTAAATGTTAGCCAAGATTAAGGGGAAGATAGCATTACATCTCACTGGTCAAATCACTGATTCGACAATGCTAAAAGTCCTCGTATGCATAGTGCCGTCAGGGCTACTAATTTCTTTATTTTGACAGGGTGATCTCCTGCAAAAAGTTGTGGATGAACTGAAGAGTGATAATTTCATAACAGACGCACTCTCAATGGGCCAAACCAAGTTTATGGTAATATTAACCAACAACAGAAAATTTTGAGATTTGTTCATCCTAGTGTGATTTTTCAGGGAGTTTGCCAGCTACCCTGCGCTGAATTAGAGAAATTGCAATCAGAAGATAAGGTTCCTTCTTTTAGAAGACTAGACATACGGTATGTTGATTCAGTTGATGAAATATACTCCTGTCTGTGGCCTGTGGGCCTGCGGTAGTGTTAGAACGACTCTAGTCGAGTCTTTCAGGTGACTACTCGCTCAACGATGACTCGGTGTGTGGGATTATTAAAGTCAATGTCGAGTCACCGAGTATTTTAGTTTACGGCTTATGCAATAAATCATATATGCACTGGTTTCATGATATAAATGAAGACTAATGTACTTGATAATAACACTGGTCAACAAAATGAAACAAAGTTTTTTAGGCAGAACATCTGAGAGCCGTTTCTGGGGTTTTTGAGGTTGCTGATTACGAATATCACATTAGTTTTGTCAGATTGGCTCTCTGTCAGAAGATATTTATACCCCTAAAAAAGCCCAAAATTACTGTATTTNCCCTTNAATATTTCACTTGGTNGGAAGAAAATCGTAGTTTTTTTCNAATTTTATACTGCGCATAAATNGCTAATTGACTNTGAAGAACCCTCNTGTCATTCTCAGTCATTCTATCAATATTAACNTGNCATGATGCNAAATATTTGTTTGTCAAAAAAGCAGTTTGTCAAGCCTNAAAATTGTACATGTGCACAACGAAAATTCATATTCTCCTGTATCAATTGGTCATTCTACCAAGATTTAAGAGGCGTATAAAACTATAACATTTGTCCTTGAAAGGCTTAACTACAATACTCATATGTGTCTCATTTCTTTTGACTGGTAAATGGATAATTTTCCGCTGAGTCAACAAAGTGGGTATACCTATCAAACACTATCAAACGGGAAGCTCAAATCTGGTATATTCGGATATCGATGAAAGATTCCAATTTCACATTAGGAAGGAGTTCACTGCATGAAAATTCTCCTGAGATGCAGTAAATAAAACTTTTTAGATGATCACAAAGCACCCAACTACAAACAGTGGTCCGAAAATTCGTATCTGCATATCGAAAACTTGAGCACAAACATGAGCATAAAAGTTCACTTCCTATTCAGTCATCTTGATATATTTCCTGATCATCTTGTTGATTAGTAAGGGGATAGGTTCTACCGAGACATCAGAACAACAAAAGAAAGATATCAGGACAGATGAGATGAACATTTGAACATAATATGTCAGACCATTGCCGCACCGTTTCGAGAAACTGCACTAAATAGCTTACAGGCGAAAATCGTACAAAAAGCAATTATGGTAGAAAATATAACAATATTATTGTATTCCAACTGATTATTTCAAATTTACAATAGGTGGTTGACGTGAAACCGATTGAATTAATGCCACGTTATTCGAGTATCTAGGTAAATACTTTTATACATGACTGAAGTTTATTTAGGTACAGTACATGATATCCGTGAAAGTCTGTAACTATGATAAATCTTATACCCTAAATATAGTGCTGTTGCTGTATTTTGATTTAAAAGAGTGTGTAAAAATAACAAGTAGATTGAATTTCTAAACTTTATTGTACGACTGAGCCGATTTTATATCTCGTCATTACCGCGAAAATAGGAGATTTTGGTCAAAATAGCCCCATGGGTTATCTCCACAACAAGAGCCAATTTGAAAAAACTAAGGTCATATTCGGAATCAGTGCCCTTCAGAACCCCCAAAACCACTCTTACTTTGTCTGCCTAAAAATATGTGTTGACCAGTGTAATCAATAATAAAGGGCTGTGCACATGGTCCTTGCACTAAATATGAATCGAGTATTAATTCCAATGATTTATTTAGAGTAGTAGTGAGAGATGTTTTTTTTTCAAGTATTAAAACTATAAAGTAAATATATTATATAAAAATCGTGACTCGAGTTATTACAACCCTGGTTAGTGGAAAAACATATCTGTCAAGTCGTAATCAACCCACACCCGCAGCATTGTCACAAAATGCAATGAAATAGGTATTGTCGAAAAAATTCCGAATGATCGTCGATGTGATCTGGAACGGGCATTACCTTCTTTTCGTGGTTGCATTAACGACACGTTGCATATATTAACTTTCTCCATCATTCATACTGTTGAGACGGCATATGGAGTGATACTCAACTCGATTCAGAATGGAATCACCCTGGTACTTTATTTTGCCCAGCCCCACCTGTGACATACGGCCACATTCCTCTGAATTGCAGATTGATTCCATGCGATCAATACCCTTGCGCTCTGCTTTATTTCACTGGCAGCGATCTCTTCAACAAACGCATGAGAGGTATAGCGTTGGAAAAAGGCTTCACAATCAATGAGTATTCCATCAGACCGCAAGGATCAACAGGTATGTCGAGTAAAATCTCGAATGAATGCGGAAAGATTGCTTTCCTTCCGGTTGGTGTGATTTCCAATAAATTGGTTGCTATGCAGGAATCGCTGGCGAGCCGCTGCCCGTATCATGTGAAGAAGACATCTTTGATTACATTGATATGAAATTCGTACCTCCGAGCGATCGAAGCGAGTGATTGCAAGTGAATATTTGTGTCTGGATGAAGACGATTAGCTTTGCTTCAATTCATTTTTAAATATTAGCCACAGTTGTAAATGAAGTGTCCCGCATGATACTCTCTTGACTCAAGTTGCGGACTTATATTAGGCCTGATATATAGTCATTCGGCACATAGCCTGCTTTGGTAGGCCACGAATATACTCAAGGACCCACGACCTACCGATCAAGAAGCCGGACGCATCGCCTTTACACTATCTCGCTCGCAAGAACGCCTCACCTGGGAAATTGTAAGGGTGGTAGTAAAGTCTAGATTTAGCAAAAACAGGTCGATCAGCGTCGCTACTGTGACTAGACTCTAGAGCAGTGGTTCCCAACGTGGGCGATATC
2 CAGGGGTGTACGAGTTTTGAGCAAACGTTAAAAGGGTGTACCACGTCGAAAAAGGTTGAAGAGCACTGATCTAGACTAGTCTAGTCTAGATATCCCTGAGTTACATGAAGAGCTTTCACTTGTCTACGTCTACAGAAACATGACTAGTTATTTGTGTATCTGTATATCAAATTAGCAGTCATTCTTCGAATACATGACATCGACGTTGTCGTTTGTGACGTGAAAAAGCAACTACATCGTTGCAGACTGCAGCGTCGCGTCACTTCCGGGCTAATTCACCATTTGGCTCGCAAAATGCTACTATGAAAACGGATATGACTGACTTTTACTGTTTGCGTCTAAAAAGAACGATCGAGAAAGTTCGAGCACTGCATGTTTCATCGGACATTAGAACGAGGTGGATGCGAGATAATGCCTGGTCCTTTAGACATCCCCCTATTTGTTCATTACACGTCATTGTGTCTGGTATATCGCTTTGTACACTGTGTGTCTTGGTTACGAGTGCATAGCCACTGCCATATCTGGGATGGCAGTCAGAGCACGCTAAACTGCGGGTTCAAGTATATTGTCTCTGATGTATTTTCAGTTTTTAATCCACGAATCTCTATTCTCTACTGCGAGTACATTTGGCCTACCTTGGAGATGGAGAGGACTCCTTCCACGAGGTAAAAATTGCAGCACTGCGTCTGAATGATTTATTTTCAGTCTTTCGGCAGAAATGGCCACGATTTTTCATTAATATTGCCTACCCAGACTCTAGATAGGCCTGTCCAGACTGGCCAGTGGTTAAAGGCATTATTGTCGCTGCAATCACACAAAAGATTTCCGAGATATGCGTAATAAAAGGTAAGCCACAATTTCATTCAGAATTAGCATCCGCTAATGCAAGAAAAGAAATATTTCCTAATGAGCCAACACGTCATTGTCGCGATGAATAATAAGTATGGGTCCGCTGGTTTGTCGCGATAACAGTGTATTTATTATATACTCACCATTTTTGTACCAAGACAGTACACGGATATATCTTGTCTCAAAATGCGGGCAAGTGTTCTTATCGCCCACTGATCAACATGAAAACAGTAGGTTTCAATGTTTTATGGCCTGGATTAATCCGACTCTATCCAGACTTGAAACTATATGCCACCTACAATGAGACCAGAGTGGTCAGCTGTCCGCTATACGATACATTCAATACGGGCGAATGCAACTTACAACAGAACCAGCAAATTAGTTCAGATGTAGCTCGAGCACAGGACGAACCGCGAACTGCTATAAACTGACTTCACGTCAATCCTGCATCTACTCAAGATAACATTGGCCGGAACGCTTGAAAAAAAGCCTCCATCATATATTTGAATCCATTCGACTGCATATCTTCCACTGCGCCGACAACGCGCTCACGCTTAAAACCAAACAACAAGTCAGCACGCCACGCGAATATATTCCTTTTTCTTTTATTGAAAGCTGAAGTGAAGCACCAAACAAAAACGAAAAATTAATGTAACGAAGCATGATACAATCGAGAACCCAAAGCACTCTGGATTACACATAATAGCCAGGCAAATAGTAGAAAAAAGTATTTTTGAGAAGCTCGAAAAATCAAAATGCCGGTATAATCGTCTTTTGATGCAGAATCGGTAGCAGTACAATTATCGTCTTCGAGATTCCCGGGGTTTACAAAAGTCGGGAGAATTTTGCATATCGGGTTTCGTTTTCAGTCGAAAAAGTAAATTTTGCTGTAGGCTCGTGAAATTTTGAATCGTCCGCGTGACCTCGCGGCCTAAAATTAGTGCTCTGTTCGGTGACTAGGGGCGGTACGATTTTGAATAAGCAAATTAAGCGAAGCGAGCATTTCGCCTGTTCGGATTTCTCGAAACCGGCGAGCGCCCGGGCGTTCATCCATACACATAGGCATCTACGTTCTAAACAAAACGGAAAGAAAATAAAAAGTCTTATACGGGTCGTAGTAGCAGCAGTAAGTATTGGATCTAAGCGAATGATAAAATATCAAATTAACGAATTGAAAAGTAAGGGAAAGAGTTTAAAAAAGAAATTAGGCGGGTGGGGATGGGCGTCATAGTATATGGTACAGGAATGCACGCGGGCAGTTCGGGGCAACACACAGAAACATTGAAGTGTCCTTTGACATGATCAGACGGAACAAGGCAACAAAGCTGTAAGACGCATCGCAAAGACTAGCCAATTAGAAAGCTCCTCAACTAGACTGTCCAGAAACGGCTGCTCCGGCCTGCTCGGGATATAATCGGTTACCAACACGCGGCAGTCGAATAGCGTAAATATGATCGGGGCATTTCCGCGGCAACAAAAACTCGCAATCAAGGCGACTAATGGTTATCGAATCGATATGATTATGAACTTCTACCTTGTAAGGCTTCAAGCGTTTGACAGTAGAGGCAGTGGCTGGCTATTGAACGACAAAAGATCGAGCGACGCTCTACAATTTTGGCGAATTCCAAGATTCAAACACTCCGAAGAAAAAACACACAAAACAGGCCTAATATATCGAGCAGATTTGGCCGAAAAGTCGACAGAACGCAAGTCCGCATTCAAACTGGGGCCGCCGATGAGCAGTAACACAAAAAAAGCATGTTACACCCACCAACATGGCGAGAATCCTCTCTATTTCAGTCAAGAAGCACCAAAAACCAAACAAAAGTATCTTGCTGACACTGAGGTAGTGTGGGGACACACGGGGGCGGCGTGACTAGTGGTTTTTTAGCGTTGTTGACCGACAAACGTTCGTGCAAGGGGACAAAACACAGACCCCCAAACACACAGTGGACCATTGCGACACAAAGAAACGAACCAACAACAAACAAGCGAACGCACAAACATAAACGCTTTACAACAACACTGGAATACGCGAGGGCAATGAATACTTACGGCGAAATATTGCTAAAAAAGAAATCGGCCGACAACGTGATGCCGAAGTAACGAAAAGAGTAAACTGTCATCATTCCTCCATCCCCAGACCGGAAAAAACATCTACAAAACAGGGTAAGGCGGGCCCGAGTCCGTTAAGGGCATTATATTTTGAATCCTCCCACGTTGTCGAACGTGCGGTACCGACNCAGGACGGCGGACAAAAGCTCAAGTTCAAAAACCGTCTTTCTCTGATACTGGAGGGATTAAATAAGGAATAAATAAGGAAATCTTGAGAATGAAAATTTGCCTACAAGATGCCTGTATAGCGGTCTCAGTTTTTAAAGTAAAACAGTCTCCTCTTCGCTCAAGCACTCAAAGCCGTCNGACATCGCGTCNGAACGGGCCCCAGAACCCCGAGAGTTCGTGACTTCGCCCGGAGACTTGGACACNGGCGCTATAAACGCCCGGATCCCGGCCGAAGTCTGTTTGAGCGTGGACACGGCGCGCTTAGGACCTGCAGGCTCGAGCCGCAGCACTAGTTCCTGAGCCGACGCCCCTGCACCTTCTTGGGACACCCTACGCGCAATGTAGTATCCCCCGTTCGAGAAAATAGACGGAGAAGGCGGTAGAGAAGACAGAGGTGACACGCTAGAGTCTTCGTAGTCGGACTCGAGATCACTCTCAGGAAGACGAGTCGGGTTAGCGGCAGACTGGGCACGCACGAGACGCTCCGCCAGCCGTTTACCCCTNGCCCTCAACCTCTCTTTTTCCGCGGCCAGGTTGGCCTCGGTCCTCTGCAGCTCGAGACAGTAATCGCGCGCTTTGTTCAAGATGTGCACTTTTGGAGTCTTCTCCTGCCTCTGCAGCTCGGGCACGTTGTCGCGCAGCGTCAAGAAGGAAGTACGCAGGCCCTCGCGTCTCTGCCTCTCGAGGACATTGTGAGCGGCCCTGATCTGCTCCGTGTCAGATCCGGTGCCGGGCGGTAGCATCTTAGCCAGGACTTCGGCCTTGCGTTTTCGCTTGTTGACAGGTTGGATACGAATACGCGTGCCTTCCGTTTGCTCCTTGATTTCAATTGGGGTTACGTTCTGATTATACACTCCGAATTCGGTCATGACGATNTCGTTATCGTCTGGGTCACGTCGGACTTTTGTGGTGGCGCAAAACGACACGCCTTCTAACGAGAGAATGCGTTTCTTGTCAAACCGAGCGACCGGCGATAAGGAATCGTTGCCTCTCTGCATCACCCTTTTCGGGTTGGCCATTTTCATCAAGTTCTGCGTCTCGTCCGTGGTGTGCCGCCTGCCCGCTAACGTGGCGCTGGTCTGGTCCGCGACGCGCGGTATTTTGGGACCGCTCGCAGTCGTGATGAGGTGGAATTTGTTTTTGGCACGNCCGCGTTCGGTTTCGGCGTTTCGCGCGATTGTCCGAACCAGCCCCTTCGTGGACAGGCTGCTGCCGGCGCTGGTCACAAAGGCTAGCTGCCCGTCTTCGTTTGGCACGAGGGTGGCGACTATTTTCGGCGACGCCCCGGTCTTGGCTTTCAGGGCCGTGGCGTTCTGGCTTTTTTCGACCGTCACCACATCGATTTCTTCCTCTGCAAAGAAATGTAACGATTTTACCGAAAGTCGGAACATAGGATGCGAAATCTGACATACGTCAGCGTCATAGTAACACTCCCACGCAGAAGTGATCAAAGAAACCGTCGTTAGTAATCAAGTAGACGTAAACGTTTTGTCGTAAATCTCTACTCCAAATAAATCAGTAGAAGCAGAAAGTAGTCAAAAGCCACCTGATTTAATTGGATAATTTAGAAGTACAGTACTGAGAAACACCTCATGTCGCGTGGGATAACCAGGGCCATACATAGAGTCGACGCAGGTTCTAATAAACGGCGACNAGTCACGTTAAAGCTGTCAGCGCGACGATAAAACAGTACGGAAGCCGGGATCGTATTTCAAGCCTCGCATCCTGCATTTGTGTTCTGTTTTACCGAGCTCGCTGGTTTCACAGTGGAAGCCGCGCAACGTTCGACACACTGTAACCGGACGCNTGTTCGTCTGAATCAAGACNCGGCCTGATTTTCGAACCGACATCAAATTTAAAGACCTTCC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6 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TATTGTCCATTCTCGGTAATGTCCATTCTCGGTATTGTCCGTTCTCGGTAATGTCCACTCTCGGTAATAGCATTCTCGGTAATGTCCATCTCGGTAATAGCATTCTCGGTAATAGTAGGGAACCAGCTACTCGGCGTCTCAAAACTGTAGCCGCCAAACGCCATCTAGCGTCACCAGTTCAGCCGCCAAACGCCGTGTAGACATTCGGCCGCCGCGCGGCGTTTGGCGTCTGGCGTTTGGCCTCTGAGCGGGTTTAACCCCTGTTGATGATTTGGTTGACTACCATGTCACGTGGTGGCGTATTGTTTTGATTACTGCGGCTGCATTGAGTAACCGAAAACGTCCGCCTTTCACTATGTCTTGCGCAGCGTCGCTAACAAAGTAGCTCAATTCAAGGTGTTTTCTGCCGACGTTGCATAAGACATATTGTGGAAATAAGAAACTCGCAGTTGAGATCTGATTGTTCCATCGGTGAGATCGAATTTGTCGATTAGAATATATTGTGTCACGAAATTGAGAGGCAGATGAAATGATCAACCCTTCACCCACCCAATTCGCCATCGCCTACGGTGTTAGTGTTTTTCTGTCATTCTTTATTCTTATACCCGCAAGCATCGACTCGCACAATATGCGTGGAAATTGTTTGCTTACTGCAAAAGGTGAGAATAATGTAACCTGTGTGTTCGCTTTGTGCTTATGCTTTGAATATGGTTTTGATTCCTTTGAAACACGCTACGGTAATCCATGAGTACCAAGTTCGGTAGTATATGGCAGTGCGAAATCTTTTGGTGCTGTGTGTTGTGTCTTAATATTAACAAAGAACGTAATCCTATTTCTTTTTTGCAGGTTATTGGAATGAAACAAATGAACTGGTTGTGACATGGGGTCATCGATCAGCCTGCAATTTCATAGTGTTCATGGGTGTAGCATGCTTGCTATCCTCTCTATACTTCTTCTGGAACAGCATCTACTCTGTATGCAAGGGCTATGACGGGTAAGATGGGATGTACCGGTACTAAATCAGCTGACTAAAACTGAATGTAATTTCCATTAACAGCTCACCATTATTTTGTTTTGTTTCTCTTTTGCTGGGGGCATTTATGACAATTTCATTACTTTCTTCGTCGTTTATTGTTTCACTTGGTTACTCGTCTTGGTGTGACATTGTGACAGGAAAAAAAGATAATAGCCAAGTGTAAGTACATATTGCAAATATGATAGACTTGCATGCTATTTTAATGTAATGATGATGAATATGCAATTCTCAGGTGCTGGAAAGTTGACCTTGGAAATTTTAATAAAGAGTATCATGTGAACAGTGATGATTTTAGTTCAGACTTGGAAATTATTGAGGTATGTAATTTTATGACTTGTCTGGTAGATTCTCATATAGGCCAGTCTGCTTTTACTGGTTCCAACAGGCAACATTTACAGTATTTCCGTAATTTTGGTGGGTTGAAACTTATCCCTTGAATCCTTAAATCCCTTGAAAGAGCCTTCATGTTGACTATAAATTGTAACTTTTACATGACGTTAAATCGGACATGAAAGCTTTTTAATTTTGCTAGTGTGGGGGGTTGCCACAGCAGATCAGTGATTTGCATTGTGATCCGTCCTAAGCTGCACCCGTCCTTGGTGCCGGCTGGTACTAGTCTTGCTGACCATTGGTGTGTGAGACATCGAAGATATTTTGTCCCCATAATTCCTGTTGGTTGAACAAGGACTTGCCATGATCGGATTTTGCTTGTATTGTGTGTTGCTTGTCTAGCCATGCCGATACCATCTACATGACCAAGTTTCTACATCAATCAGCTTTGCTATTATCATCATATTATAATTTTTCAGTTTGGTTCATGGAGTTCTACTCTATCGTGGGTTGCCGCGACGGTCCTATCCTTCTTCAAAGTAAGATACTACCATAAAAATGAAGAACTCATTCAAGGACTGGCTTTGGAAAAGGATTCTCTCATTCCGTATCGGTTGCGTTATCAGAAAATCGACGAGGGTTCCTCATATACCTAATGTTGCATCCATCAATTCCTTATCCGTTCCTCTACTGCAGTTATTTTTGCCTCGCCATCAATATACACCGTGCTTACTGAGTATTATATACACACCTATACTACGTGGTTATTTCTGATATTATGTGGAGTATATCAATTAGCAGTTAATGGGAGTGGTTATATATGGATTCTAGAGAGCGCCTGTCATGATTCATCAGTGAGGTTGCAAGCTAGTTATGGCAGCGAATTTAAACTACCTGTCTAATGAGCTAATGGAGGGAATTTCGACCTCACCCTTACAAATGTTTGGCATGCTTGGGTTTATAGTCAAATTCGCTGCTATTAATCAACTCGTGGCTAGTAGACCATAATCCAGGGTTGTCACGACTCGTCTCGCAATTTTCTGATGACTGGAGTCATTTCCTCAAAATACGGAACAACTCGAGACTCAGATGGCCAAGATCGACATGTCATTGTAATTACGAAGAATAGTAAAAGTAACCACACTATTGCGATTTCATCTATTGGTACTGGAGAATGCTAAAAGTGTGGAAAATTAGTAGAATATAAATGTGAACCATTCGATATCACTCTACAGTGCAATCAACACGATGACTTGGACTCAACCTACTGCTCGCTGACTTGGACATAATACGGTGTTGAATTGAAAATGACTCGAGTCAAAACTATAACAGTGAAATTGGTTTGTGACTCGGAGCTGTGTGACTTGGTCACAACCCTGCCATGATTCTCCAGTTAACAATAGCAGCGAACTTGACCTGTCTAATGCTGATCTAATGGAGTGAATTTTGACCCCTTCCTTACAAAAAGTATGCAATATGGTCTGTTAGCCATGATTCTCCAGTTGGGGTAACTCGATCATACATCATGCAATAGCAGTATATTCACACAATGACTAAGATAACAGCGGTAACATGAAGGCAGTAACGCGAAAATGATCGCTGACACATGCTTACAATTGCGAATTCAGCAGTTTATTTACACGATGAGAAAAAGAAACAGCGGTAACATGAAGTCAAAAAGGCAGCAAAGCGAAAATGATGGTCAACAGATGCTTACTATTGCGAACTTGGCAATGAAATCACCACAACAGATAGCACAAAATGTCATCAGCACTACACTGCGTAATGCTTTTAGTAACAACCACAACAGATGATGGCACTTACCATTGACTTTGCATATTGAATTTAGTCTTCACTAAATATCTCAAGTTCACTTGCGCTACATCGTACACTATGTATTCATTGTAGAGTAACGACGTTCCTTCACAGCCAGACTCCTTCCCGGACCCTACATGGGCTATGGTGCCATCTTTCATCGTGTAGTCGCTCGATTCGTCCGGGCATGTGGACCCCATACCCTTGACGCTGTGCTTTCCTTTCGGTAGCTTCCGTACGTCCATGGCATTCTTCAACTCGCGCCTAAAAAAAGGTGGCACGTCGATATCACTGTACAAACAAGTGCACACTCAGTAATGAACTCACATATTTCCCAGCGCTACTTCAGCGAGCAATAACAGTCCGTATGGATTCCCATGCGACGCATGGCAGTAATTCGCACTTTTCGAAACCATATCGGCAAAGTACAACCCCTTGCCGAACATATATCCCGTCTGTAATGCAAGAGTCATAATTTTCCAATGCAGTAGCAGGTGAATATAGAGGTTTTTGCAAGCAATTTTTGAATGCAGGGAAGTGACGATAAAGCATTTTTCAAACTGGACCGTTCAGTGTTTGTGACAGGGTGACTAATAATGAAGTTTATACAGATTAACCTGTGCGGATCACCTCGATAAGATACACTCGCCATATCCAAGTTGTTTCGACCGCTTGCTATCTTTTTATTTTATCACAATTTTGTGGTACTGTCAATTGATAAATTCATCATTAAACTGAACGGAACCGACATGAAACCAGCGGGGTCAATCAAATGTGCAAAGGCCTCTTCCATAGGCTAATGCAAACATGGAATATGTTTATAAACCATTTCCAGCGGAGGACGCACCTTTGTTCTTGCATGGTCTCAGAACAAACGCCTGGGCGAGTTTTGGGTGGGAATGGGTGATTCAGTGCCCTAGATGTCAACAAGTGGATACTAAAATCAGGCAGAAAGAATCTATTTACATTAGCGCACATCAGGAACCAAAAGGCGATAAGTGCCGAAATTCGAGCGAACAACATTTCATGACGTACCACAGGCGCTTCGGGCGGCGCAATCCTCAAGCCCTGTGACAAAATGCCGGCGTAGTTGGTCACACGAGAGCCATGCCACAGCAAACGACGGTTGTGCAGCTTCTTGAACGGCCGGTAGCGGCTTTTTTCACCTTAAAAACTGACGAGGTCAGCCGTCGCCACGTCAGACGATTACGAGTTCATTCAGCCTACCTTTACGGTCCAACTCAAATATTTCTTCGACTTCGAGACTGTATGCGGAATGGGTCTTGGCGTGAGTGTTTTGCACCATGTCGCCGATCACGTTACGCATTTCGTCGTTGGCATCGAGTGGCTGCGGAGAAAAATTTATTTTCCGACCGTGAATACCAGAGGCGGTCAGTAACAAAGTGCTTCTACTTTTCATACCAAACTCCAGTGAAAACATGTATTTGATGTCTTCTACGCTACTTTCTTCCAAGTAGTTTTCTGTCTACTTGCAATAGTTGATCAAGTGGTTACGATTTTAAACTGCTACTTCTACCTAACAAAAAAGTTCTAGAATTACTAGAAAGTCGCTACTTCTATTTGTGCTCAAGTAGATGAGATAGTCAGTAAGGAAGTACTCGTCTTCAAGAGGTATTCAATACTTACTCAAGTGGTTTTAATTTTCAACTACTGCCACTCACCAGTTTCGAGTGTTAGGCAAAACTAGGCCTAGAATACTTTTACGTAATTGGAAACCGTTACTTCTACTTGCATTTGAGTATCAACAATGACTACTTTGACAACATCTGGTGAAAATGCTCCGGACAAGTTGGGAAAC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Although we were able to identify sequences from the contig database that match really well with our selected genes, there will be cases where we may not utilize them anyways. Particularly, if there already exists sequences on NCBI that are labeled as the complete CDS for our GOI for Botryllus schlosseri, then just use this directly in PrimerQuest. For GOI’s that do not have this, proceed with the sequence extracted from the contig data base and plug it into ORF Finder before taking the sequence to PrimerQuest.
Locating Protein Coding Regions (CDS)
Before we use PrimerQuest, we want to identify the open reading frames of the GOI sequences if the sequence has not already been identified as the complete CDS on NCBI for Botryllus schlosseri. An open reading frame (ORF) is a portion of a DNA molecule that, when translated into amino acids, contains no stop codons. Doing this step will improve the specificity of our primers as to make sure we are targeting the protein coding region of the gene.
Go to ORF Finder and plug in one of the gene sequences from our extracted_sequences csv file.
This means you will use ORF Finder for sequences that are labeled as partial CDS and for gene sequences that were identified for Botryllus schlosseri through a closely related query organism’s labeled gene sequence.
From here you can take the sequence produced and plug it into PrimerQuest. Make note of which ORF you will use in your primer design excel sheet.
Designing Primers with IDT PrimerQuest
We will be using SYBR Green for the qPCR we are conducting so when on PrimerQuest select qPCR Intercalating Dyes (Primers only)
General rules for designing good primers:
- 20 nucleotides in length, ideally
- 50% GC content, ideally
- Tm’s of forward and reverse primers must be similar (2oC differences tolerated).
- Primers cannot form stem-loops (hairpins) upon themselves. On PrimerQuest, it will show you the probable hairpins that may form and associated values relevant to stability, melting temperature, etc. You will want to select primers that have the fewest number of hairpin possibilities and have the lowest absolute delta G value (free energy) which would indicate lowest stability. Additionally, you want primers with hairpins at lower Tm’s (melting temperature) since it indicates that that secondary structure will more likely unwind even at the lower temperatures during the PCR reaction.
- No primer-dimers greater than 6 bp between each primer and itself and also between the two primers.
- Forward and reverse primers should be about 500 bp apart.
- The 3’ end of the primer should be a G or a C.
- Amplicon product should be 70-200 bp in length.
Final Primers
Number | Gene | Forward Primer (5’-3’) | Reverse Primer (5’-3’) | NCBI Accession Number (If complete CDS) | Botryllus Contig Sequence (if no complete CDS was found) | Amplicon Length | Source |
---|---|---|---|---|---|---|---|
1 | BAX | CATTGACCTTGCGTGTTATTGG | AAGATGTCCTTGGTGGGTTG | KU948200.1 | None | 97 | in house |
2 | POU3 | CAGTAGGTCTTCGCATCCATC | CGTTTGCATCGTTGGTGTAAG | KU948203.1 | None | 80 | in house |
3 | PolB | GGCTTCACAATCAATGAGTATTCC | AGCAATCTTTCCGCATTCATTC | None | botctg092056 | NA | in house |
4 | TNF | GTTTCAGTCAACACCTTGTGTC | AATCTCGACCGCTGACTTATAC | None | botctg065850 | 131 | in house |
5 | SOXB1 | GGGAATGTGTTCATCCTCTGG | TGAATCCAGGAGTTACTCAAGTTC | KU948203.1 | None | 116 | in house |
6 | MYC | GAAGTCCTGGCTAAGATGCTAC | AGCGTCAAGAAGGAAGTACG | KU948203.1 | None | 119 | in house |
7 | AIF1 | GGATTCTCTCACCGATGGAATAG | CCTGACTTGGAGCCTTTATGG | KU948202.1 | None | 102 | in house |
8 | SOD1 | CAATCCATATAACAAGGTTCATGGC | TGATATCCACACAGGCACAAC | EE743567.1 | None | 107 | in house |
9 | PARP1 | AATTTGGCACCGCTCATTTC | TGCAAGACCTTCAGCTTCTC | KU948201.1 | None | 94 | in house |
10 | SIRT6 | ATTAGTACCGCGTCTGGAATAC | GGATGGAATCGCTTCTTCAAATC | None | botctg109566 | 114 | in house |
11 | IAP7 | GGTCTCTTCACGGACATCTTC | GCTCAGTATGTTGTGCTTGTTC | KU948203.1 | None | 111 | in house |
12 | HSP70 | CGAGAAGTTGAAGGACAAGATCTCCG | TCTCTGCAGTCTGGTTGTTGTCGAGC | NA | NA | NA | doi:10.1016/j.ydbio.2017.10.023 |
13 | Mortalin | TTCATGATACCGAAACCAAGATGGACG | AATTTCCTCCTTGATGGCATCCACC | KY212120.1 | None | 79 | doi:10.1016/j.ydbio.2017.10.023 |
14 | ACTb | GTAGGTAGTCTCGTGAATTC | CACGCCATCTTGCGTCTGGA | NA | NA | 321 | doi:10.1016/j.dci.2006.12.009 |
15 | 18s | GGCAGCCTCCGGGAAACCAAAGTC | CTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTC | NA | NA | NA | doi:10.1016/j.ydbio.2017.10.023 |